細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建技術(shù)服務(wù)

一、研究背景

穩(wěn)轉(zhuǎn)株即穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，指的是基于某一細(xì)胞系構(gòu)建的持續(xù)過(guò)表達(dá)或干擾某特定基因的細(xì)胞系。其相對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染而言，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的外源基因在短時(shí)間轉(zhuǎn)錄翻譯得到的蛋白量少，且在細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)或干擾效果的維持時(shí)間很短，一般不過(guò)1至2周，僅能夠滿足小量蛋白的制備，大量生產(chǎn)成本很高。反觀穩(wěn)轉(zhuǎn)株能夠長(zhǎng)期過(guò)表達(dá)或沉默特定基因，從而能更好地對(duì)該基因的一系列機(jī)制進(jìn)行解讀，在生物學(xué)研究中穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建具有舉足輕重的意義。

細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)是通過(guò)將外源基因整合至宿主細(xì)胞染色體DNA中，建立長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)目的基因的克隆化細(xì)胞系的核心技術(shù)。慢病毒感染-藥物篩選法是目前廣泛運(yùn)用的穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建方法，具有高效整合，目標(biāo)細(xì)胞廣泛等特點(diǎn)。該技術(shù)包含載體構(gòu)建、質(zhì)粒合成、慢病毒包裝、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、抗性篩選與單克隆分離幾個(gè)關(guān)鍵階段。相比于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的短期表達(dá)特性，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染建立的細(xì)胞系能持續(xù)表達(dá)目標(biāo)蛋白超過(guò)6個(gè)月，廣泛應(yīng)用于基因功能研究、藥物篩選和大規(guī)模蛋白生產(chǎn)領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需優(yōu)化抗生素濃度、病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞比例等核心參數(shù)，并通過(guò)Western blot或流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證基因表達(dá)穩(wěn)定性。

二、技術(shù)簡(jiǎn)介

逸漠生物采用的包裝系統(tǒng)是二代包裝系統(tǒng)，即三質(zhì)粒系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括1個(gè)包裝質(zhì)粒(psPAX2)、1 個(gè)包膜質(zhì)粒(pMD2.G)、1個(gè)目的基因質(zhì)粒和1株包裝細(xì)胞(293T cell)。

逸漠生物采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染完成后48-72 h進(jìn)行病毒收獲（即未純化的細(xì)胞上清液），根據(jù)不同的試驗(yàn)需求，確定采用相應(yīng)的濃縮純化方法得到高濃度的病毒保存液，最后根據(jù)嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定慢病毒的各項(xiàng)指標(biāo)。

在一定滴度范圍內(nèi)的慢病毒顆粒對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將攜帶靶基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞，再依據(jù)載體所含抗性標(biāo)志（如真核表達(dá)載體常用的新霉素、潮霉素、嘌呤霉素等抗性篩選標(biāo)志物，實(shí)際操作中常用 G418 替代新霉素），通過(guò)對(duì)應(yīng)藥物篩選出混合陽(yáng)性克隆。

三、為什么要做細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建？

構(gòu)建細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株（穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株）是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中的重要技術(shù)手段，其核心目的是實(shí)現(xiàn)外源基因的持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)，滿足基礎(chǔ)研究與應(yīng)用場(chǎng)景的特定需求。

1、基因功能的長(zhǎng)期研究

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的局限性：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染）雖能短期內(nèi)表達(dá)外源基因，但通常僅維持 2-7 天，無(wú)法模擬基因在細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期效應(yīng)。例如，研究某腫瘤相關(guān)基因?qū)?xì)胞周期的影響時(shí)，需觀察數(shù)周內(nèi)的細(xì)胞增殖變化，穩(wěn)轉(zhuǎn)株可通過(guò)持續(xù)表達(dá)目的基因提供穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

慢性表型分析：在神經(jīng)退行性疾病研究中，需長(zhǎng)期觀察淀粉樣蛋白沉積等慢性病理過(guò)程，穩(wěn)轉(zhuǎn)株可穩(wěn)定表達(dá)致病基因（如突變型 APP 蛋白），為機(jī)制研究提供持續(xù)穩(wěn)定的細(xì)胞模型。

2、信號(hào)通路與基因網(wǎng)絡(luò)研究

某些信號(hào)通路的激活或抑制需持續(xù)刺激（如 Wnt 通路的長(zhǎng)期激活），穩(wěn)轉(zhuǎn)株可通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)通路關(guān)鍵蛋白（如 β-catenin），避免反復(fù)轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的損傷，確保通路研究的連續(xù)性。

在基因互作研究中，穩(wěn)轉(zhuǎn)株可同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)多個(gè)目的基因（如熒光標(biāo)記蛋白與靶基因），通過(guò)熒光追蹤或質(zhì)譜分析，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的長(zhǎng)期變化。

3、工業(yè)級(jí)穩(wěn)定生產(chǎn)

單克隆抗體、重組細(xì)胞因子（如 IL-2）的生產(chǎn)需細(xì)胞系持續(xù)表達(dá)目標(biāo)蛋白。例如，CHO（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞）穩(wěn)轉(zhuǎn)株經(jīng)篩選后可高密度培養(yǎng)，每升培養(yǎng)基蛋白產(chǎn)量達(dá)克級(jí)，滿足藥物研發(fā)與商業(yè)化生產(chǎn)需求。

成本與效率優(yōu)化：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染需反復(fù)操作，且蛋白產(chǎn)量低（通常＜100 mg/L），而穩(wěn)轉(zhuǎn)株可通過(guò)馴化適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)連續(xù)灌流培養(yǎng)，降低生產(chǎn)成本。

4、穩(wěn)轉(zhuǎn)株 vs. 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：核心優(yōu)勢(shì)對(duì)比

四、操作流程

五、服務(wù)項(xiàng)目

過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株

干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株定制

干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株三保一

六、服務(wù)內(nèi)容

過(guò)表達(dá)質(zhì)粒制備/干擾序列合成

目的基因的慢病毒制備

慢病毒感染目的細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)

穩(wěn)轉(zhuǎn)混合細(xì)胞株進(jìn)行抗生素篩選

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行qPCR檢測(cè)和WB檢測(cè)

七、服務(wù)流程

客戶提供：細(xì)胞材料，您可以提供自己的細(xì)胞系，也可以從我們的細(xì)胞產(chǎn)品中選擇合適的目的細(xì)胞，但是該細(xì)胞必須能夠保證足夠的可傳代次數(shù)。

我們提供：建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，以及提供建立方法，步驟及結(jié)果。

也可提供基因水平和蛋白水平的驗(yàn)證：穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株可以根據(jù)您的要求進(jìn)行基因水平和蛋白水平的驗(yàn)證， 包括qPCR檢測(cè)、WB檢測(cè)和流式檢測(cè)等。

周期：4-8 周

報(bào)價(jià)：詢價(jià)

八、公司優(yōu)勢(shì)

團(tuán)隊(duì)擁有成套完善的技術(shù)體系，進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建

制備的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株純度高，無(wú)污染

提供完整并準(zhǔn)確的檢測(cè)方案，檢測(cè)報(bào)告真實(shí)可靠

擁有低成本、高效率的制備模式，極大縮短生產(chǎn)周期